89.Voorontwerpbestemmingsplan uitbreiding trafostation Simonshaven; Bijlagen bij toelichting Bijlage 3 Verkennend natuuronderzoek

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723

22/32

Wet natuurbescherming: soortbescherming

Effecten

Nader veld- en/of effectenonderzoek

Nadere procedure/ mitigerende maatregelen

Reptielen.

Geen.

n.v.t.

n.v.t.

Vissen.

Algemene soorten.

n.v.t.

Werkzaamheden die in het water plaatsvinden dienen (vissen en amfibieën) rustig te worden opgestart zodat eventueel aanwezige dieren kunnen vluchten. De mitigerende maatregelen dienen te worden opgenomen in een ecologisch werkprotocol.

Ongewervelden.

Geen.

n.v.t.

n.v.t.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723

23/32

Bijlage 2: Toetsingskader Wnb: soortenbescherming In de Wet natuurbescherming (Wnb) is soortbescherming opgedeeld in drie categorieën. Voor iedere categorie gelden verschillende verbodsbepalingen welke zijn vermeld in artikel 3.1, 3.5 en 3.10 van de Wnb. Het betreft de volgende categorieën:

Soorten van de Vogelrichtlijn (artikel 3.1 e.v.) lid 1) het is verboden opzettelijk van nature in Nederland in het wild levende vogels van soorten als bedoeld in artikel 1 van de Vogelrichtlijn te doden of te vangen; lid 2) het is verboden opzettelijk nesten, rustplaatsen en eieren van vogels als bedoeld in het eerste lid te vernielen of te beschadigen, of nesten van vogels weg te nemen; lid 3) het is verboden eieren van vogels als bedoeld in het eerste lid te rapen en deze onder zich te hebben; lid 4) het is verboden vogels als bedoeld in het eerste lid opzettelijk te storen; lid 5) het verbod, bedoeld in het vierde lid, is niet van toepassing indien de storing niet van wezenlijke invloed is op de staat van instandhouding van de desbetreffende vogelsoort.

Soorten van de Habitatrichtlijn (artikel 3.5 e.v.) lid 1) het is verboden in het wild levende dieren van soorten, genoemd in bijlage IV, onderdeel a, bij de Habitatrichtlijn, bijlage II bij het Verdrag van Bern of bijlage I bij het Verdrag van Bonn, in hun natuurlijk verspreidingsgebied opzettelijk te doden of te vangen; lid 2) het is verboden dieren als bedoeld in het eerste lid opzettelijk te verstoren; lid 3) het is verboden eieren van dieren als bedoeld in het eerste lid in de natuur opzettelijk te vernielen of te rapen; lid 4) het is verboden de voortplantingsplaatsen of rustplaatsen van dieren als bedoeld in het eerste lid te beschadigen of te vernielen; lid 5) het is verboden planten van soorten, genoemd in bijlage IV, onderdeel b, bij de Habitatrichtlijn of bijlage I bij het Verdrag van Bern, in hun natuurlijke verspreidingsgebied opzettelijk te plukken en te verzamelen, af te snijden, te ontwortelen of te vernielen.

Andere soorten (artikel 3.10 e.v.) lid 1) onverminderd artikel 3.5, eerste, vierde en vijfde lid, is het verboden: • onderdeel A. in het wild levende zoogdieren, amfibieën, reptielen, vissen, dagvlinders, libellen en kevers van de soorten, genoemd in de bijlage, onderdeel A, bij deze wet, opzettelijk te doden of te vangen; • onderdeel B. de voortplantingsplaatsen of rustplaatsen van dieren als bedoeld in onderdeel a opzettelijk te beschadigen of te vernielen, of • onderdeel C. vaatplanten van de soorten, genoemd in de bijlage, onderdeel B, bij deze wet, in hun natuurlijke verspreidingsgebied opzettelijk te plukken en te verzamelen, af te snijden, te ontwortelen of te vernielen.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 24/32

Voor Vogelrichtlijn- en Habitatrichtlijnsoorten geldt dat voortplantings- en rustplaatsen (inclusief functionele leefomgeving) van beschermde soorten niet opzettelijk verstoord of vernietigd mogen worden en dat exemplaren van beschermde soorten niet opzettelijk mogen worden gedood of verwond. In gebruik zijnde nesten van vogels zijn altijd beschermd gedurende het broedseizoen. Van een aantal vogelsoorten geniet de vaste rust- en verblijfplaats een aanvullende jaarronde bescherming. Deze soorten worden genoemd in een beleidsdocument dat onder de Flora- en faunawet is opgesteld. Ook onder de Wnb is deze lijst van kracht, maar provincies hebben de mogelijkheid deze aan te passen. Voor provincie Zuid-Holland geldt de reguliere landelijke lijst. Soorten waarvan de nesten altijd jaarrond beschermd zijn, zijn de volgende: boomvalk, buizerd, gierzwaluw, grote gele kwikstaart, havik, huismus, kerkuil, oehoe, ooievaar, ransuil, roek, slechtvalk, sperwer, steenuil, wespendief en zwarte wouw (categorie 1 - 4). Van een aantal andere soorten zijn de nesten enkel jaarrond beschermd als er onvoldoende alternatieven zijn. Dit zijn soorten, zoals de pimpelmees, boerenzwaluw en blauwe reiger (categorie 5).

Voor Andere soorten geldt dat voortplantingsplaatsen en rustplaatsen (inclusief functionele leefomgeving) van beschermde soorten niet (opzettelijk) vernietigd mogen worden en dat exemplaren van beschermde soorten niet (opzettelijk) mogen worden gedood of verwond. Verbodsbepalingen ten aanzien van de verstoring zijn niet van toepassing op deze soorten. Ten aanzien van de andere beschermde soorten geldt dat het bevoegd gezag (provincies c.q. ministerie van Landbouw. Natuur en Voedselkwaliteit) de vrijheid hebben om soorten binnen deze categorie vrij te stellen van de verbodsbepalingen uit artikel 3.10 Wnb. Met artikel 3.10 van deze wet wordt het mogelijk gemaakt om die bescherming op te heffen om redenen die onder meer verband houden met ruimtelijke inrichting of ontwikkeling van gebieden of verband houden met onder meer het bestendig beheer of onderhoud aan vaarwegen, watergangen, waterkeringen, waterstaatswerken, drinkwaterleidingen en infiltratiekanalen voor drinkwaterproductie, oevers, vliegvelden, wegen, spoorwegen of bermen, of in het kader van natuurbeheer. Met artikel 3.189 van de Zuid-Hollandse Omgevingsverordening wordt een dergelijke vrijstelling gegeven (Provincie Zuid-Holland, 2021). De diersoorten waarop de vrijstelling voor ruimtelijke ingrepen toeziet, worden genoemd in Tabel 1.

Voor beschermde soorten die niet zijn vrijgesteld en de voorgenomen activiteiten strijdig zijn met de bepalingen in de wet, geldt een ontheffingsplicht. Deze kan alleen worden verleend, indien de gunstige staat van instandhouding niet in het geding is. De indicatoren hiervoor zijn de ontwikkeling van de populatie, de verspreiding en het leefgebied. Deze indicatoren kunnen in het projectgebied mogelijk ingeschat worden door de onderzoeker, op grotere schaal kan gekeken worden naar trends van het Netwerk Ecologische Monitoring (NEM). Voor vogels geldt in afwijking hierop dat voor verstoring geen ontheffing nodig is, indien de gunstige staat van instandhouding niet in het geding is. Het is ook mogelijk om voor beide categorie soorten te werken volgens een goedgekeurde gedragscode die is afgestemd op de Wnb. Er is dan geen ontheffing op grond van de Wnb nodig.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 25/32

Tabel 1: Vrijgestelde soorten in provincie Zuid-Holland. Zoogdieren Aardmuis Bosmuis Bunzing Dwergmuis Dwergspitsmuis Egel Gewone bosspitsmuis Haas Hermelijn

Amfibieën Huisspitsmuis Konijn Ree Rosse woelmuis Veldmuis Vos Wezel Woelrat

Bastaardkikker Bruine kikker Gewone pad Kleine watersalamander Meerkikker

Naast bovengenoemde verbodsartikelen bevat de Wnb een algemeen geldende zorgplicht. Deze zorgplicht is altijd van toepassing en geldt ook voor niet beschermde flora en fauna:

Zorgplicht (artikel 1.11) lid 1) Eenieder neemt voldoende zorg in acht voor Natura 2000-gebieden, bijzondere nationale natuurgebieden en voor in het wild levende dieren en planten en hun directe leefomgeving. lid 2) De zorg, bedoeld in het eerste lid, houdt in elk geval in dat eenieder die weet of redelijkerwijs kan vermoeden dat door zijn handelen of nalaten nadelige gevolgen kunnen worden veroorzaakt voor een Natura 2000gebied, een bijzonder nationaal natuurgebied of voor in het wild levende dieren en planten: • onderdeel A. dergelijke handelingen achterwege laat, dan wel, • onderdeel B. indien dat achterwege laten redelijkerwijs niet kan worden gevergd, de noodzakelijke maatregelen treft om die gevolgen te voorkomen, of • onderdeel C. voor zover die gevolgen niet kunnen worden voorkomen, deze zoveel mogelijk beperkt of ongedaan maakt.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 26/32

Bijlage 3: Onderzoek Datura eDNA Bodemsampling 1. Doelstelling De doelstelling van dit onderzoek is het aantonen van de aan- of afwezigheid van de noordse woelmuis (Alexandromys oeconomus arenicola) aan de hand van (e)DNA onderzoek. Hiervoor is gebruik gemaakt van bodemmonsters. Dit onderzoek is uitgevoerd in opdracht van Sweco Nederland B.V.

2. Methode 2.1 Bemonstering De bemonstering is uitgevoerd door een medewerker van Sweco Nederland B.V. volgens gestandaardiseerde protocollen van Datura (opvraagbaar). In totaal zijn er op 26 april 2023 drie bodemmonsters geleverd aan het laboratorium van Datura Molecular Solutions B.V. (Tabel 1). Tabel 1. monsterinformatie

Monster nummer 61916 61919 61917

Ontvangen op 26 april 2023 26 april 2023 26 april 2023

2.2 Laboratoriumanalyse De monsters zijn getest op de aanwezigheid van eDNA afkomstig van de noordse woelmuis. Het analyseren van een eDNA monster vindt plaats in drie stappen. Eerst wordt het eDNA in het monster geconcentreerd en gezuiverd. Vervolgens wordt een controle analyse uitgevoerd om te testen of eDNA detectie in een monster eventueel geïnhibeerd wordt door storende stoffen. Tenslotte wordt het eDNA gedetecteerd met behulp van een real-time quantitative PCR. 1.

Het eDNA in het bodemmonster is geëxtraheerd met behulp van de Qiagen Dneasy Blood & Tissue kit. Storende stoffen als humuszuren kunnen detectie van het eDNA inhiberen wat kan leiden tot fout negatief resultaat. Gedurende de extracties zijn deze inhiberende stoffen zo veel mogelijk verwijderd.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 27/32

2.

Er wordt altijd een controle uitgevoerd om na te gaan of eDNA detectie in een monster geïnhibeerd wordt. Dit wordt gedaan door een bekende hoeveelheid van een fragment artificieel DNA toe te voegen. Vervolgens wordt de concentratie gemeten van dit fragment artificieel DNA. Dit wordt zowel gedaan in een reactie waar een hoeveelheid monster aan toegevoegd wordt, als in een reactie waar geen monster aan toegevoegd wordt. Als DNA detectie in een monster geïnhibeerd wordt, dan is de gemeten concentratie artificieel DNA in de reactie waarin monster toegevoegd wordt lager ten opzichte van de reactie waaraan geen monster aan toegevoegd is. Met name in zuur water, waarin veel organische deeltjes aanwezig zijn kan inhibitie optreden. In een dergelijk geval wordt een extra zuivering stap uitgevoerd of wordt het monster verdund. Vervolgens wordt opnieuw gekeken of de inhiberende stoffen voldoende verwijderd zijn.

3.

Detectie van eDNA vindt plaats door middel van een real-time quantitative PCR. Het principe achter deze techniek is dat een specifiek deel van het DNA zeer vaak vermenigvuldigd (geamplificeerd) wordt. Datura maakt gebruik van soortspecifieke primers die uitsluitend DNA van de doelsoort vermenigvuldigen. Datura werkt gebruikt bovendien een soortspecifieke probes (een soort primer) die uitsluitend binden aan eDNA van de doelsoort. Binding van de probe aan het vermenigvuldigde eDNA van de doelsoort resulteert in een fluorescent signaal. Dit signaal wordt gedetecteerd met behulp van een qPCR platform (CFX96 TouchTM van Bio-Rad). De qPCR detectie wordt uitgevoerd met 12 replica's. Daardoor kan zeer gevoelig gedetecteerd worden. De qPCR detectie wordt uitgevoerd met de TaqMan® Environmental Mastermix 2.0 (Life Technologies®). Naast het eDNA monster worden PCR reacties uitgevoerd waaraan geen monster is toegevoegd. Deze moeten negatief zijn. Zodoende kan bevestigd worden dat de analyse schoon is uitgevoerd en er geen contaminatie optreedt. Tenslotte worden ook enkele reacties geanalyseerd waaraan een bekende concentratie DNA is toegevoegd. Deze reacties moeten positief zijn. Dit bevestigt dat de analyse juist is uitgevoerd.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 28/32

2.3 Kwaliteitswaarborging 2.3.1 Hoe fout positieve waarnemingen worden voorkomen Het optreden van zowel fout positieve als fout negatieve waarnemingen wordt tot het minimum beperkt. Fout positieve waarnemingen kunnen op drie manieren ontstaan: • De gebruikte primers en de probe zijn niet specifiek. • Er vindt contaminatie plaats in het laboratorium. • Er vindt contaminatie plaats in het veld. Hieronder wordt aangegeven hoe fout positieve waarnemingen voorkomen worden. Omdat de kans op fout positieve waarnemingen zeer klein is, kunnen we niet exact kwantificeren hoe groot de kans daadwerkelijk is. Datura kan daarom niet 100% zeker garanderen dat fout positieve waarnemingen nooit optreden. In de praktijk (middels validatie studies) nemen we echter geen fout positieve waarnemingen waar. Het is daarom aannemelijk dat fout positieve waarnemingen vrijwel niet optreden. Het voorkomen van fout positieve waarnemingen door het ontwerp en validatie van specifieke primers en probes (bij qPCR): 1.

Er wordt gebruik gemaakt van een 2-staps qPCR protocol, hetgeen de kans op aspecifieke detectie verkleint.

2.

Gebruik van zeer specifieke primers waarmee uitsluitend eDNA van de doelsoort gedetecteerd kan worden. De primers zijn ontwikkeld met behulp van specialistische software.

3.

Een qPCR detectie wordt uitgevoerd met behulp van een zeer specifieke probe. Deze probe hecht uitsluitend aan DNA van de doelsoort, hetgeen resulteert in een fluorescent signaal.

4.

De primers en probe zijn in het laboratorium getest. Eerst is getest of de qPCR detectie inderdaad negatief resultaat geeft na het toevoegen van DNA van (verwante) soorten.

5.

Vervolgens is de methode gevalideerd door het testen van veldmonsters. Er zijn eDNA monsters verzameld op locaties waar de doelsoort niet voorkomt. Er werd geen eDNA gedetecteerd in deze monsters. Zodoende kon aangetoond worden dat de methode niet resulteert in positieve detectie als de doelsoort niet aanwezig is.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 29/32

Om fout positieve waarnemingen te voorkomen werkt Datura in een specifiek voor (e)DNA ingericht laboratorium omgeving en worden strikte procedures gevolgd: 1.

Verschillende onderdelen van de analyse workflow worden uitgevoerd in fysiek gescheiden laboratorium ruimtes. Het samenstellen van de eDNA monster kits en het voorbereiden van de qPCR reagentia vindt plaats in een DNA clean room. Dit is een ruimte waarin geen DNA monsters aanwezig zijn. Zodoende kunnen we garanderen dat er geen DNA aanwezig is in de eDNA monster kits en de reagentia (zoals de primers en probes) die later gebruikt worden in de eDNA analyses. Het extraheren van de eDNA monsters gebeurt in een eDNA laboratorium. Dit is een ruimte waarin uitsluitend lage concentraties DNA aanwezig zijn. Vervolgens worden hier de eDNA monsters samen met de qPCR reagentia in een 96-well plaat gepipetteerd. Deze plaat wordt luchtdicht afgesloten. Tenslotte wordt de qPCR uitgevoerd in een post- PCR laboratorium. In dit laboratorium wordt het eDNA vermeerderd en hier zijn dus hoge concentraties DNA aanwezig.

2.

Er wordt een unidirectionele workflow gehanteerd om contaminatie van de DNA clean room en het eDNA laboratorium te voorkomen. Dit houdt in dat materialen die eenmaal in het post-PCR laboratorium geweest zijn niet meer terug mogen naar de DNA clean room en eDNA laboratorium. Ook medewerkers van Datura mogen niet dezelfde dag van een post-PCR laboratorium terug naar een ruimte waarin weinig DNA aanwezig is.

3.

In iedere analyse worden controle analyses uitgevoerd. Zo worden er monsters geëxtraheerd waaraan geen slootwater is toegevoegd (zogenaamde extractie controles). In de qPCR worden naast de extractie controles ook negatieve PCR controles meegenomen. Zodoende kan heel nauwkeurig gemonitord worden of er inderdaad geen contaminatie optreedt.

Om contaminatie in het veld te voorkomen worden de volgende maatregelen genomen: Het bemonsteringsprotocol van Datura wordt gevolgd. Dit protocol schrijft een specifieke werkwijze voor. In de praktijk is gebleken dat er geen contaminatie plaats vindt als dit protocol gevolgd wordt.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 30/32

2.3.2 Hoe fout negatieve waarnemingen worden voorkomen (qPCR) Naast fout positieve waarnemingen kunnen ook fout negatieve waarnemingen optreden. Er is dus altijd een kleine kans dat eDNA niet gedetecteerd wordt, ook al is de doelsoort wel aanwezig. Door meerdere monsters te nemen kan de kans op fout negatieve waarnemingen aanzienlijk verkleind worden. Maatregelen die genomen worden om fout negatieve waarnemingen te voorkomen: 1.

Per monster worden meerdere submonsters verzameld. Hiermee wordt de kans vergroot dat eDNA in het monster terecht komt.

2.

Een zeer gevoelige qPCR detectie in eDNA water- en bodemmonsters wordt uitgevoerd met behulp van 12 replica’s. Wanneer minder replica's uitgevoerd worden kan er minder gevoelig gedetecteerd worden. Meer dan 12 qPCR replica's leidt echter niet tot gevoeligere detectie.

3.

Gebruik van een zeer korte merker van maximaal 100 basepaar.

4.

In ieder monster wordt vastgesteld of de qPCR detectie geïnhibeerd wordt door storende stoffen. Indien dit het geval is wordt er een extra zuiveringstap uitgevoerd. Vervolgens wordt nogmaals getest of de inhiberende stoffen er inderdaad geen inhibitie meer optreedt (zie methode voor een uitgebreidere beschrijving).

5.

Er wordt altijd een positieve controle van de doelsoort DNA meegenomen in de qPCR detectie. Deze controle moet altijd resulteren in positieve detectie. Ook als alle monsters negatief zijn, kan zodoende vastgesteld worden dat de detectie juist is uitgevoerd.

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723 31/32

3. Resultaten Er is in 1 van de 3 bodemmonsters eDNA van noordse woelmuis gedetecteerd. Dit gaat om monster nummer 61919. Een overzicht van de resultaten van dit onderzoek wordt weergegeven in Tabel 2. Iedere analyse is uitgevoerd met behulp van 12 replica’s (zie 2.2 Laboratoriumanalyse). De resultaten worden weergeven als het aantal replica’s (van de 12 replica’s) dat positief scoorde voor eDNA van de doelsoorten in de betreffende monsters. Als er een score van “0/12” is verkregen, betekent dit dat er geen eDNA van de doelsoort in het betreffende monster is gedetecteerd. Als er minstens 1 positieve replica is verkregen (bijvoorbeeld ‘1/12’ of hoger) dan betekent dit dat er eDNA van de doelsoort is gedetecteerd. Het aantal positieve replica’s is een grove maat voor de concentratie eDNA van de doelsoort: bij een laag aantal positieve replica’s (bijvoorbeeld ‘1/12’) is de verwachting dat de eDNA concentratie van de doelsoort zeer laag is. Er is geen amplificatie waargenomen in de negatieve controle reacties waar geen sample aan toegevoegd is. De positieve controle reacties waar DNA van de doelsoort aan toegevoegd is werden wel geamplificeerd. Dit geeft aan dat de analyse juist is uitgevoerd. Tabel 2: Resultaten q-PCR analyses voor noordse woelmuis met 12 replica’s.

Monsternummer 61916 61919 61917

Resultaat qPCR analyse noordse woelmuis 0/12 1 / 12 0/12

Sweco | Aanvullend natuuronderzoek hoogspanningsstation Simonshaven 380kV Projectnummer 51010255 Datum 11-07-2023

Versie C1

Document referentie NL23-648800269-54723

32/32